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蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案

更新時(shí)間:2024-01-04      點(diǎn)擊次數(shù):583

裂解緩沖液:

為了準(zhǔn)備在凝膠上運(yùn)行的樣品,需要裂解細(xì)胞和組織以釋放感興趣的蛋白質(zhì)。這會(huì)溶解蛋白質(zhì),使它們可以單獨(dú)遷移通過(guò)分離凝膠。我們使用 RIPA 緩沖液 (beyotime P0013B) 來(lái)提取全細(xì)胞提取物和膜結(jié)合蛋白。

蛋白酶和磷酸酶抑制劑:

一旦發(fā)生裂解,蛋白水解、去磷酸化和變性就開(kāi)始。如果樣品始終保存在冰上或 4°C 下,并且將適當(dāng)?shù)囊种苿┬迈r添加到裂解緩沖液中,這些事件可以大大減慢。 Pmsf是我們經(jīng)常使用的蛋白酶抑制劑。

組織裂解液的制備

用干凈的工具解剖感興趣的組織,最好在冰上,并盡可能快地防止蛋白酶降解。均質(zhì)化前應(yīng)將 RIPA(含 1mM pmsf)冰冷。

將組織切成小片,對(duì)于約 20 mg 的組織,將約 250 μl 裂解緩沖液快速加入管中,用電動(dòng)勻漿器(或玻璃勻漿器)勻漿直至全裂解。

在微量離心機(jī)中于 4°C 下以 10000~14000g 離心 5 分鐘。輕輕地從離心機(jī)中取出管子并置于冰上,吸出上清液并置于冰上保存的新管中;丟棄顆粒。

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:

使用 PAGE 凝膠、Bradford 測(cè)定、Lowry 測(cè)定或 BCA 測(cè)定。牛血清白蛋白(BSA)是一種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

制備用于加載到凝膠中的樣品:

要變性,請(qǐng)使用帶有陰離子變性去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的上樣緩沖液,并將混合物在 95-100°C 下煮沸 5 分鐘。

    1. 清潔玻璃并設(shè)置電泳系統(tǒng)。

    2. 制備PAGE膠,根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇不同濃度的分離膠:

蛋白質(zhì)大小 (kDa)凝膠百分比(%)
4-4020
12-4515
10-7012
30-10010
50-2008
  1. 4%堆積膠,選擇預(yù)染色的蛋白質(zhì)Marker Proteins的大小,以幫助區(qū)分蛋白質(zhì)大小和電泳示蹤劑。

  2. 上樣跑膠,每孔加樣量20-40μg蛋白,加樣時(shí)注意不要溢出到相鄰孔中,造成膠戳孔和交叉污染。

  3. 按照電泳方法推薦的說(shuō)明進(jìn)行電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)將凝膠耗盡時(shí)終止凝膠電泳。

  1. 將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。 (根據(jù)trans-blot系統(tǒng)推薦的說(shuō)明。)

  2. 查看膜中的蛋白質(zhì):麗春紅。轉(zhuǎn)印后,用麗春紅染料染色約2~5min,檢查轉(zhuǎn)印是否成功。然后用蒸餾水沖洗掉染料。

  3. 封閉膜一般用5%脫脂牛奶,或3%~5% BSA。 4 ℃搖床振蕩封閉過(guò)夜,或37 ℃封閉2小時(shí)。封閉后TBS洗滌5-10秒。 

  4. 與一抗一起孵育。按照推薦的抗體稀釋度,用TBST(或1%~3%脫脂牛奶)稀釋抗體。然后將膜裝入自封袋和固定層壓機(jī)中,將抗體溶液添加到自封袋中,并確保膜與足夠體積的抗體一起孵育。

  5. 37℃振蕩孵育1~3 h(根據(jù)抗體效價(jià)和親和力),或4℃過(guò)夜孵育,TBST室溫?fù)u床上洗3次,每次5~10 min。

  6. 與二抗孵育,同步驟(4),用TBST稀釋?zhuān)?7℃振蕩孵育1~3 h。

HRP 偶聯(lián)抗體的化學(xué)發(fā)光、顯影和固定:ECL 是使用的傳統(tǒng)試劑盒。

在暗室中,將顯影劑和固定劑分別裝入塑料托盤(pán)中,在離心管中混合兩種試劑(A 和 B 的體積)。確保膜表面蛋白與混合物充分接觸。 1~2分鐘后去除殘留物。

紅燈處取出膠片,打開(kāi)膠片夾,將膠片放在膠片上,取下膠片夾,根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間,記住曝光過(guò)度的膠片不適合分析。

曝光完成后,取出膠片,迅速浸入顯影液中,終止顯影。顯影后,應(yīng)立即將膠片浸入定影液中成透明膜。用自來(lái)水清洗除去殘留的固定劑后,在室溫下干燥。 


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