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lumafuor高效retrobeads操作說明

更新時間:2023-12-11      點擊次數(shù):802
一、包裝及稀釋: 
Lumafuor 的珠子裝在密封小瓶中,并將濃縮的珠子懸浮在蒸餾水中。如果使用紅色微珠作為神經(jīng)通路的逆向示蹤,推薦稀釋方法:大鼠視覺皮層可采用1:4稀釋,且不會降低微珠熒光標記的強度和質(zhì)量。但對于第一次實驗,我們不建議使用稀釋的微珠,而是使用原液進行進樣示蹤。除蒸餾水外,也可使用常規(guī)鹽溶液如 NaCl 和 KCl 作為稀釋劑。如果使用綠色珠子,強烈建議使用原液而不需稀釋。 
二、儲存:
為了避免蒸發(fā),珠溶液應(yīng)保存在4度冰箱中。不要冷凍它!冷凍的豆子將毫無用處,無法使用。干燥后的珠子也不能使用(不能重新懸?。?,產(chǎn)品沒有明顯的使用壽命。如果按要求保存,可保存數(shù)年。 
三、注射: 
珠子最好使用壓力注射,如1ml Hamilton 微量注射器或氣動注射系統(tǒng)。如需小面積顯微注射(30-50nl),可采用末端直徑為30-50um的玻璃電極進行注射,而較大直徑的玻璃電極可用于常規(guī)反向示蹤(注射量0.1-0.3ul)。然而,即使劑量較高,珠子也不會從注射部位顯著擴散(通常小于 1 毫米)。因此,為了盡可能完整地標記投射到更大核的神經(jīng)元,需要多點注射。盡管珠子帶負電,但不建議將離子滲透法用于示蹤珠子。 
4、生存時間:
在大多數(shù)恒溫脊椎動物系統(tǒng)中,檢測珠子的最短有效時間是24小時。 48小時內(nèi),標記強度隨進樣時間增加而增加,48小時后熒光強度保持恒定。對于冷血動物,建議檢測珠子的時間為 1 周。目前尚未檢測出珠子的最長可檢測周期。然而,珠子的熒光強度和質(zhì)量可以在體內(nèi)至少14個月保持不變,并且細胞可能被長時間標記。尚未發(fā)現(xiàn)珠子對動物或神經(jīng)元有毒性作用。
五、固定及處理:
標準固定方法是:0.1mpbs洗滌或灌注并固定在4%多聚甲醛中(0.1mpbs制劑,pH7.4)。用戊二醛固定會產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光,這會阻礙珠子標記的神經(jīng)元。而且戊二醛固定的組織中不會全觀察到綠色珠子,因此應(yīng)盡量避免。如果使用冷凍切片,則應(yīng)使用 PBS 沖洗切片并用明膠包被的載玻片干燥。風(fēng)干后,載玻片應(yīng)用二甲苯放置 1 分鐘透明,然后用熒光封片或 krystalon 密封。 Fluoromount可以從atomrgic chemetals Corp. (Farmingdale, NY)購買;克里斯塔隆可以從
Harleco(EM Industries,新澤西州吉布斯敦)。切片只能短時間接觸乙醇或二甲苯,但長期接觸(超過 5 分鐘)會損壞珠子。微珠對甘油非常敏感,在甘油環(huán)境中熒光會很快被提取。因此,不宜使用甘油封孔劑。如果無法避免,可用水楊酸甲酯代替甘油作為封閉劑。如果將切片保存在黑暗環(huán)境中,熒光珠標記的細胞一年內(nèi)無法提取(但切片的熒光背景會增加)。到目前為止,還沒有珠子標記的組織涂有塑料材料的記錄。
觀察:
紅珠中的染料是羅丹明,所以所有與羅丹明配套的熒光濾光片都可以使用。尼康公司一些舊的羅丹明濾光片由于背景較高,可能無法觀察到熒光珠。一般情況下,蔡司、徠茲的標準羅丹明濾光片可以獲得較好的觀察效果。大多數(shù)綠色熒光濾光片都可以很好地觀察綠豆的熒光結(jié)果。設(shè)置為熒光黃的濾光片可以獲得強烈明亮的熒光,但也帶來較高的背景干擾。結(jié)果表明,較寬波段的熒光濾光片比窄帶濾光片可以獲得更強的熒光信號。經(jīng)過長時間的觀察和拍照,珠子的熒光沒有出現(xiàn)。


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