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酶法金相學(xué):一種簡單的新染色方法

更新時間:2023-08-02      點(diǎn)擊次數(shù):529

將有機(jī)底物酶促轉(zhuǎn)化為深色、不溶性反應(yīng)產(chǎn)物被廣泛用作免疫組織化學(xué)中的檢測方法[1],并且也已用于原位雜交檢測[2]。盡管應(yīng)用廣泛,但它并不適合所有應(yīng)用。產(chǎn)品的擴(kuò)散可能會限制分辨率,并且染色的連續(xù)性可能會掩蓋底層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。與其他細(xì)胞染色劑的對比度可能低于預(yù)期,最近開發(fā)的鎳基增強(qiáng)試劑已經(jīng)解決了這個問題,該試劑與二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合,產(chǎn)生較暗的信號[3]。某些應(yīng)用還需要比直接酶染色更高的靈敏度;這通常是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等擴(kuò)增方法 [4] 或半抗原化底物(例如生物素化酪胺)的催化沉積來實現(xiàn)的[5]。然而,這大大增加了程序的長度和復(fù)雜性,并且還可能受到擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)散的影響。

我們發(fā)現(xiàn),在適當(dāng)?shù)慕饘僭春突罨瘎┐嬖诘那闆r下,辣根過氧化物酶綴合的探針可以選擇性地沉積金屬,從而產(chǎn)生黑色的、高度局部化的染色。圖 1-4 所示結(jié)果顯示了新型金相基質(zhì)與傳統(tǒng) DAB 開發(fā)在人類乳腺癌中的比較。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟、水合并使用蒸汽熱進(jìn)行 HIER(抗原修復(fù))30 分鐘。用3% H 2 O 2封閉內(nèi)源性過氧化物酶后溶液5分鐘,切片與一抗孵育30分鐘,隨后與Envison檢測試劑盒(Dako Corp)孵育30分鐘。對照(圖 1 和 3)用 DAB 顯色劑染色 5 分鐘,并用蘇木精復(fù)染 2 分鐘;實驗切片(圖 2 和 4)用金相基質(zhì)處理 7-8 分鐘,并用甲基綠復(fù)染。與 DAB 相比,染色的點(diǎn)狀性質(zhì)和非常低的背景結(jié)合程度是顯而易見的。該方法還被發(fā)現(xiàn)對原位雜交檢測高度敏感(圖 5),并且在平行免疫印跡中產(chǎn)生的染色比 DAB 染色深得多(圖 6)。

[人物] (197k)

圖 1 和圖 2:對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌進(jìn)行黃體酮受體(單克隆抗體 PR-88)染色,然后進(jìn)行 (1) DAB 或 (2) 酶金相分析(條 = 50 微米)。

圖 3 和 4:乳腺導(dǎo)管內(nèi)粉刺癌,使用多克隆 c-erb-B2 一抗對 Her 2/neu 進(jìn)行染色,然后進(jìn)行 (3) DAB 或 (4) 酶金相分析(條 = 25 m)。

圖5:中等擴(kuò)增對照細(xì)胞系(4-6個拷貝)中Her-2/neu的原位雜交檢測;每個點(diǎn)對應(yīng)于該基因的一次出現(xiàn)。使用鏈霉親和素、辣根過氧化物酶和金屬沉積混合物檢測的生物素化探針(放大倍數(shù) x 1,000)。

圖 6:(上)使用辣根過氧化物酶的新金相底物開發(fā)的免疫印跡。將2微克HRP沉積到硝化纖維素上,用4%BSA封閉,然后用金相基質(zhì)處理; (底部)使用標(biāo)準(zhǔn) DAB 開發(fā)的相同目標(biāo)。


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